Optimization of culture medium composition using agro-industrial by-products for the production of Silk-Elastin-Like Proteins by Escherichia coli

Abstract

Nos últimos anos, a investigação associada ao desenvolvimento de biopolímeros tem vindo a ganhar um ímpeto significativo, impulsionada pela necessidade de encontrar materiais inovadores, com propriedades aprimoradas e menor impacto ecológico. Os polímeros proteicos recombinantes (rPPs) são um exemplo de novos materiais inovadores e, entre eles, as proteínas do tipo Seda Elastina (silk-elastin-like proteins, SELPs) demonstram propriedades únicas. Estes polímeros são compostos por blocos de aminoácidos encontrados na seda e na elastina e são produzidos em fábricas celulares microbianas, em processos tipicamente à escala laboratorial. Para o escalonamento a nível industrial a níveis economicamente viáveis, é de extrema importância otimizar o processo de bioprodução. Adicionalmente, a crescente consciência ambiental implica o desenvolvimento de processos sustentáveis recorrendo a, por exemplo, abordagens de economia circular. A substituição de componentes do meio de cultura por subprodutos/resíduos de setores como o agroindustrial permite reduzir os custos associados ao meio fermentativo e contribuir para uma economia circular. O presente projeto visou otimizar a bioprodução de SELPs em condições de fermentação descontínua, utilizando Escherichia coli como modelo microbiano (fábrica celular microbiana), e meios de cultura formulados com subprodutos/resíduos agroindustriais nomeadamente, soro de queijo, glicerol e licor de maceração de milho. A otimização do meio de fermentação foi analisada com recurso a técnicas clássicas nomeadamente, ‘one-factor-at-a-time’ e ‘central composite design’ (CCD). Para além da otimização do meio de cultura, procedeu-se à seleção de mutantes com produção reduzida de ácidos orgânicos através da técnica de ‘proton suicide’, resultando na obtenção de um mutante de E. coli com a capacidade de produzir maior quantidade de SELP. As análises por CCD demonstraram que a utilização de subprodutos industriais foi eficiente para sustentar o crescimento bacteriano e promover a elevada produção de SELP, resultando numa diminuição dramática dos custos associados ao meio de fermentação.

In recent years, research and development of biopolymers have been gaining significant momentum, driven by the need to find innovative and promising new bio-based materials. Recombinant protein polymers (rPPs) are an example of such innovation-driven outcomes and, among them, Silk-Elastin-Like Proteins (SELPs) demonstrate unique properties and have been used for an assortment of different applications. In order to scale up to industrial levels and achieve economically feasibility, it is important to improve the efficiency of the bioprocesses, ideally, by reducing the costs of protein production and improve production yields. Moreover, the increasing environmental consciousness favours the consideration of circular economy approaches for the design of sustainable processes. Accordingly, the use of industrial residues/by-products in the fermentation bioprocesses represents a convenient approach, not only to replace expensive media ingredients, but also to comply with the circular economy framework. The present dissertation targeted the optimization of SELP bioproduction in batch fermentation conditions, using Escherichia coli as microbial cell factory and alternative culture media formulated with agro-industrial residues/by-products namely, cheese whey, glycerol and corn steep liquor. The optimization of the media based on these agro-industrial by-products was analysed through classical medium optimization techniques namely, one-factor-at-a-time (OFAT) and statistical design with central composite design (CCD). Also, we explored the use of a proton-suicide approach for the high-level biosynthesis of SELP by generating mutants with the ability to produce lower amounts of organic acids, pushing forward the high expression of heterologous recombinant proteins. CCD studies demonstrated that the utilization of undervalued industrial by-products was efficient to sustain bacterial growth and promote the high expression of SELP, leading to great improvements over protein expression and a dramatic decrease of costs associated with fermentation media.