Yeast as a model system for the study of carboxylic acid transporters

Abstract

Os transportadores de membrana de ácidos carboxílicos desempenham papéis cruciais nas indústrias biotecnológicas emergentes, ao aumentar a eficiência das fábricas celulares microbianas produtoras de diversos produtos químicos de plataforma, relevantes para vários setores industriais. A utilização de proteínas transportadoras, exportadores e importadores, permite ultrapassar problemas importantes na produção biológica, tais como a acumulação de produtos intracelulares, aumentando o seu exporte, além de fornecer uma maneira eficiente de promover e regular a entrada de substratos. Neste trabalho, o estudo de transportadores de membrana foi realizado através da sua expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. Uma dessas investigações resultou na expansão da gama de substratos para Ato1, um transportador de acetato de S. cerevisiae. Mutações na região FLY (F98A e L219A/S/G/V), o local de constrição mais estreito do transportador, melhoraram significativamente o crescimento em ácido lático e permitiram o crescimento em ácido succínico, ampliando sua especificidade de substrato. A mutação E144A aumentou a sensibilidade ao ácido acético. Noutro trabalho foram identificados e caracterizados dezasseis transportadores de carboxilatos da levedura Cyberlindnera jadinii tendo o CjAto5, CjJen6, CjSlc5 e CjSlc13-1 exibido a gama mais ampla de substratos. A conservação da região de constrição FLY de CjAto foi fundamental para a especificidade do transportador, tal como no Ato1, também membro da família AceTr. Estudos filogenéticos, previsões de estrutura 3D e ancoragem molecular ajudaram a entender a dinâmica funcional desses transportadores. A caracterização dos exportadores CexA (citrato) e Dct-02 (malato e succinato) de Aspergillus niger também foi realizada neste trabalho. A reconstrução filogenética das famílias DHA1 e TDT, juntamente com previsões estruturais 3D e estudos de ancoragem molecular, orientou a seleção de resíduos para mutagénese dirigida. O transportador CexA é capaz de importar citrato com baixa afinidade por difusão facilitada. As mutações P200A, Y307A, S315A e R461A prejudicaram o transporte de citrato. Os resíduos R192 e Q196 estão envolvidos no exporte de citrato, mas não afetam o importe. A expressão heteróloga de alelos de DCT02 em S. cerevisiae revelou mutações (R59E, R59L e T136S) que diminuíram o crescimento em ácidos carboxílicos, comparado com células que expressavam o Dct-02, sugerindo um aumento de exporte. Os mutantes R114A, R114H, E130A, P204A, L210A, R255A, G275A, F279A, F279H, F279Q e F353A estão associados a fenótipos de perda de função. Análises de dinâmica molecular do CexA e Dct-02 calcularam os perfis de energia livre, suportando o papel de alguns resíduos no reconhecimento do substrato, e identificaram um novo local de ligação ao citrato no CexA. Estas abordagens forneceram informações sobre a complexidade estrutural dos transportadores de membrana, com ênfase nos exportadores.

Membrane transporters of carboxylic acids hold pivotal roles in emerging biotech industries by increasing the efficiency of microbial cell factories for the production of diverse platform chemicals relevant for various branches of industry. Employing transporter proteins, exporters and importers, allows to overcome a major problem in biological production, the accumulation of intracellular products, by promoting its export, while also providing an efficient way to promote and regulate substrate influx. In this work, the study of membrane transporters was done via heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. One such investigation resulted in the expansion of the substrate range of Ato1, an acetate transporter from S. cerevisiae. Mutations on the FLY region (F98A and L219A/S/G/V), the narrowest constriction site of the transporter, significantly improved growth on lactic acid and enabled growth on succinic acid, broadening its substrate specificity. The E144A mutation increased sensitivity to acetic acid, attributed to enhanced transport capacity. Sixteen transporters from the yeast Cyberlindnera jadinii were identified and characterized as carboxylate transporters, with CjAto5, CjJen6, CjSlc5, and CjSlc13- 1 exhibiting the broadest substrate range. The conservation of the FLY constriction regions of CjAto was key for transporter specificity, similar to the AceTr family member Ato1. Phylogenetic studies, 3D structure predictions, and molecular docking, helped to understand the functional dynamics of these transporters. The characterization of the citrate exporter CexA and the malate and succinate exporter Dct-02 from Aspergillus niger was also done. Phylogenetic reconstruction of the DHA1 and TDT families, along with 3D-structural predictions and docking studies, guided the selection of residues for site-directed mutagenesis. CexA is capable of importing citrate with low affinity by facilitated diffusion. Mutations P200A, Y307A, S315A, and R461A impaired citrate transport. The residues R192 and Q196 are involved in citrate export while not affecting import. Heterologous expression of DCT-02 alleles in S. cerevisiae revealed that three mutations (R59E, R59L, and T136S) decreased growth on carboxylic acids, compared to cells expressing Dct-02, suggesting an increased export activity. Mutants R114A, R114H, E130A, P204A, L210A, R255A, G275A, F279A, F279H, F279Q, and F353A are associated with loss-of-function phenotypes. Steered Molecular Dynamics analyses of CexA and DCT-02 calculated the free energy profiles for certain mutants, supporting the role of specific residues and revealing a new binding site for CexA. These approaches provided insights into complex transporter functions, with emphasis on exporter proteins.