Vascular alterations in Alzheimer’s Disease - role of Aß peptide and Transthyretin?

Abstract

Na Doença de Alzheimer (DA), a barreira hematoencefálica (BHE) é disfuncional, contribuindo para a acumulação do péptido β-amilóide (Aβ) no cérebro. Além disso, a membrana basal (MB) do cérebro, que regula as caraterísticas da BHE e a angiogénese é mais espessa na DA, como é evidenciado pelo aumento da camada de colagénio IV, e suspeita de afetar o efluxo cerebral do Aβ. A transtirretina (TTR) é uma proteína neuroprotetora na DA, no entanto, os seus níveis estão diminuídos devido à sua instabilidade tetramérica, afetando a capacidade da TTR se ligar ao Aβ. Contudo, os níveis de TTR podem ser aumentados e a interação TTR/Aβ melhorada por pequenos ligandos, sendo a base para a criação de um programa de triagem de drogas, focado na procura de pequenos compostos potenciadores da interação TTR/Aβ, como estratégia terapêutica na DA. Este projeto teve como objetivo avaliar o envolvimento da TTR na vasculatura cerebral, em contextos fisiológicos e patológicos. O trabalho realizado também pretendeu avaliar o efeito de dois estabilizadores tetraméricos da TTR, administrados a ratinhos com DA, nos depósitos amiloide de Aβ. A atividade angiogénica da TTR foi confirmada usando o ensaio in vivo da membrana corioalantóica de embrião de galinha e a análise in vitro revelou que a TTR regulou positivamente a expressão de IL-6, IL-8, VEGF e Ang-2. Os níveis de colagénio IV nos microvasos cerebrais aumentaram em ratinhos TTR+/- com 3 meses de idade relativamente a TTR+/+. A comparação entre DA/TTR+/- e TTR+/- revelou maior conteúdo de colagénio IV em ratinhos com DA, sugerindo que a redução da TTR tem um impacto maior na BM no contexto da doença. Células endoteliais do cérebro incubadas com oligómeros ou fibras de Aβ expressaram mais colagénio IV do que as células controlo. Esse efeito foi neutralizado pela TTR, resultando numa menor expressão de colagénio IV. Os efeitos do iododiflunisal e tolcapone, foram avaliados in vivo num estudo longitudinal por tomografia por emissão de positrões (TEP), em ratinhos AD/TTR+/-. Aqui é descrito apenas a análise final dos depósitos amiloide no cérebro, por imunohistoquímica, após o sacrifício dos animais, aos 15 meses de idade. Os resultados não mostraram diferenças, embora só possamos concluir acerca do efeito desses compostos após a análise dos resultados da TEP nas diferentes idades. No seu conjunto, os nossos resultados sugerem que a TTR é angiogénica e os seus baixos níveis na DA parecem ter impacto nas alterações vasculares que ocorrem na DA, corroborando a atividade neuroprotetora da TTR.

In Alzheimer’s Disease (AD), the blood-brain barrier (BBB) is dysfunctional, contributing to the accumulation of amyloid-β peptide (Aβ) in the brain. In addition, the brain basement membrane (BM), which regulates features of the BBB and of angiogenesis, is thicker in AD, as evidenced by an increase in the collagen IV layer, and is thought to impair Aβ brain efflux. Transthyretin (TTR) is a neuroprotective protein in AD, however, its levels are decreased due to its tetrameric instability, affecting TTR ability to bind to Aβ. Despite this, TTR levels can be raised and the TTR/Aβ interaction enhanced by small ligands, being the basis for settling a drug screening program focused in the discovery of small compounds enhancers of the TTR/Aβ interaction, as a therapeutic strategy in AD. This project aimed at assessing the involvement of TTR in brain vasculature, in physiological and in pathological contexts. The work performed also intended at evaluating the effect of two TTR tetrameric stabilizers, administrated to AD mice, in Aβ amyloid burden. The angiogenic activity of TTR was confirmed using the in vivo chick embryo chorioallantoic membrane assay and in vitro analysis revealed that TTR up-regulated the expression of IL-6, IL-8, VEGF and Ang-2. Levels of collagen IV in brain microvessels were increased in TTR+/- 3-month old mice relatively to TTR+/+. Comparison between AD/TTR+/- and TTR+/-, revealed higher collagen IV content in AD mice, suggesting that TTR reduction has a greater impact in the BM in the context of disease. Brain endothelial cells incubated with Aβ oligomers or fibrils expressed more collagen IV than control cells. This effect was counteracted by TTR, resulting in decreased expression of collagen IV. The effects of the iododiflunisal and tolcapone, were evaluated in vivo in a longitudinal study by positron emission tomography (PET), using AD/TTR+/- mice. Here is reported only the final evaluation of amyloid burden in the brain, after animal sacrifice, at the age of 15 months, by immunohistochemistry. The results showed no differences, although one can only conclude about the effect of these compound after examination of the PET results, at the different ages. Altogether, our results suggest TTR is angiogenic and its decreased levels in AD seem to impact in the vascular alterations occurring in AD, further corroborating the neuroprotector activity of TTR.