Application of antisense technology to control Candida glabrata infections

Abstract

The increasing prevalence of Candida glabrata infections, driven by its high intrinsic and acquired resistance to azole antifungals, represents a major therapeutic challenge and underscores the urgent need for new antifungal strategies. Traditional antifungals, such as fluconazole, often fail due to multidrug resistance mechanisms, particularly the overexpression of efflux pumps regulated by gain-of-function mutations in the PDR1 transcription factor. To overcome that, antisense therapy (AST) has emerged as a promising gene-targeted approach capable of modulating gene expression at the mRNA level with high specificity, but its application in pathogenic fungi remains largely unexplored. This study explores the potential of AST to overcome C. glabrata’s antifungal resistance by silencing PDR1 gene expression using an antisense oligomer (ASO). A chemically modified anti-PDR1 ASO, was validated in silico, targeting a specific region of the PDR1 mRNA. Whole genome sequencing of C. glabrata clinical strains revealed mutations in the PDR1 gene but it is expected that conserved sufficient sequence identity for anti-PDR1 ASO binding. In vitro, the oligomer alone induced a statistically significant and dose-independent reduction in C. glabrata growth (~20%) and reduced PDR1 gene expression by approximately 30%. When combined with fluconazole, the anti-PDR1 ASO increased the antifungal efficacy of this drug reducing the growth of C. glabrata (also ~20%). To evaluate the in vivo effect of the anti-PDR1 ASO, the Galleria mellonella model was utilized. The results showed that the anti-PDR1 ASO encapsulated in cationic liposomes DOTAP:DOPC:PEG (LipoASOs) was able to improve larval survival by 14% at 24 h and 21% at 48 h, indicating partial protection when used as monotherapy, and the co-administration of fluconazole and LipoASOs significantly improved larval which was survival increased by 24% at 24 h, similar to the healthy control, and by 34% at 48 and 72 h, compared to the diseased controls. Overall, this study presents the principle that ASOs targeting PDR1 can effectively regulate gene expression, restore sensitivity to fluconazole, and improve host survival. The results support AST, especially when administered through optimized liposomal vehicles such as DOPC-based systems, as a promising strategy for controlling resistance in C. glabrata.

A prevalência crescente de infeções por Candida glabrata, impulsionada pela elevada resistência intrínseca e adquirida aos antifúngicos à base de azóis, representa um grande desafio terapêutico e ressalta a necessidade de novas estratégias antifúngicas. Os antifúngicos tradicionais, como o fluconazol, muitas vezes falham devido a mecanismos de resistência a múltiplos fármacos, particularmente pela sobreexpressão de bombas de efluxo reguladas por mutações com ganho de função no fator de transcrição PDR1. Para superar este problema, a terapia antisense (AST) emergiu como uma abordagem genética promissora capaz de modular a expressão génica ao nível do mRNA com elevada especificidade, mas a sua aplicação em fungos patogénicos permanece pouco explorada. Este estudo explora o potencial da AST para superar a resistência a antifúngicos de C. glabrata ao silenciar a expressão do gene PDR1 usando um oligómero antisense (ASO). Um ASO anti-PDR1 quimicamente modificado foi validado in silico, visando uma região específica conservada do mRNA de PDR1. A sequenciação completa do genoma de estirpes clínicas de C. glabrata revelou mutações no gene PDR1, mas é esperado que tenha preservado identidade de sequência suficiente para permitir a ligação do ASO. In vitro, o oligómero isolado induziu uma redução, estatisticamente significativa e independente da dose, do crescimento fúngico (~20%) e reduziu a expressão do gene PDR1 em aproximadamente 30%. Quando combinado com fluconazol, o ASO anti-PDR1 aumentou a eficácia antifúngica do fármaco, reduzindo o crescimento de C. glabrata (~20%). Para avaliar o efeito in vivo do ASO anti-PDR1, utilizou-se o modelo Galleria mellonella. Os resultados mostraram que o ASO anti-PDR1 encapsulado em lipossomas catiónicos DOTAP:DOPC:PEG (LipoASOs) foi capaz de melhorar a sobrevivência das larvas em 14% às 24 h e 21% às 48 h, indicando proteção parcial quando utilizado como monoterapia, e a coadministração de fluconazol e LipoASOs aumentou-a significativamente, sendo um aumentou de 24% às 24 h, semelhante ao controlo saudável, e 34% às 48 e 72 h, em comparação com os controlos infetados. Este estudo apresenta o princípio de que ASOs direcionados ao PDR1 pode regular eficazmente a sua expressão genética, restaurar a sensibilidade ao fluconazol e melhorar a sobrevivência do hospedeiro. Os resultados suportam a AST, especialmente quando administrada por meio de veículos lipossomais otimizados, como uma estratégia promissora para o controlo da resistência em C. glabrata.