Microfluidic hydrogel biofabrication for high-throughput screening, modeling and quantifying 3D biological phenomena

Abstract

The functionality of living tissues depends entirely on their intricate 3D composition, architecture, and mechanics, which result from the complex interplay between cells and ECM. Correctly approaching these characteristics will be fundamental to engineer next-generation platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Further, the capacity to miniaturize 3D microenvironments for faster composition screening and discovery will also be critical to benefit from the ever-growing toolbox of 3D hydrogels and tissue-like cues that can be integrated into engineered constructs. Within that arena, microfluidic biofabrication is a potent tool to miniaturize 3D cell-laden hydrogel constructs. Still, these are only relevant as models if important tissue characteristics such as 3D cell/ECM architectures are integrated. Additionally, the complexity of 3D models is only helpful if some tools and methodologies enable efficient and reliable quantification of ongoing biological events into measurable data. This thesis presents advances in all these critical perspectives, aiming for microfluidics to fabricate improved 3D platforms that can model, screen, and quantify biological events with unprecedented efficiency. Initially, we demonstrate how the microfluidic manipulation of hydrogel precursors can be employed to create 3D gradients with space-varying mechanics and material composition. Allied to automated single-cell screening, we show how optimal hydrogel formulations can be detected with highthroughput to elicit biological responses ranging from cell adhesion to the triggering of stem cell differentiation. Then, we explore how 3D flow-focusing microfluidics can introduce a plethora of 3D architectures within hydrogel microfibers, using a single-chip, down to sub-50μm diameters. We demonstrate how different architectures can be combined with various cells and materials to model 3D cancer invasion, vascular tissue networks, or function as all-in-one tissue engineering platforms. Finally, multi-compartment hydrogel fibers are interfaced with light-guiding in polysaccharide-based optical fibers. These fibers can detect 3D mechanical deformations, the presence of biotargets of interest, and transport live cells while simultaneously guiding light. The living optical fibers are then used to convert complex biological events into directly quantifiable optical signals, tracking the 3D growth of a cancer fiberoid and revealing inhibitory drug thresholds with unprecedented efficacy. Overall, this thesis demonstrates the wide adaptability and capabilities of microfluidic-driven hydrogel biofabrication, presenting high-throughput for miniaturizing, modeling, and direct conversion of complex biological events into quantifiable data, with high potential for the future of precision and data-driven medicine approaches.

A funcionalidade dos tecidos biológicos é totalmente dependente das suas características 3D, nomeadamente composição, arquitetura, e mecânica, que resultam da complexa interação entre células e matriz extracelular. Recapitular estas características in vitro será fundamental para criar as próximas plataformas para modelar tecidos saudáveis e doentes. Para além disso, a capacidade de miniaturizar microambientes 3D para uma mais rápida análise e descoberta da composição ideal será crítico para beneficiar da ampla lista de hidrogéis 3D e as suas modificações, em engenharia de tecidos. Nessa perspetiva, a biofabricação por microfluídica é uma ferramenta poderosa para miniaturizar estruturas de hidrogéis, mas estas só serão relevantes como modelos se capazes de integrar as importantes características dos tecidos, como a referida arquitectura 3D em termos de células e matrizes. Para além disso, a complexidade destes modelos 3D é útil apenas se existirem metodologias capazes de quantificar os eventos biológicos que lá ocorrem. Esta tese apresenta avanços em todas estas perspetivas críticas, usando microfluídica para a fabricação de plataformas 3D capazes de modelar, analisar, e quantificar eventos biológicos com alta eficácia. Inicialmente, demonstramos como a manipulação microfluídica de precursores de hidrogéis pode ser usada para gerar gradientes 3D com transições na sua composição e propriedades mecânicas. Combinado com a análise de respostas de células individuais automatizada, mostramos como formulações ideais de hidrogéis podem ser detetadas com alto rendimento, para induzir respostas biológicas desde a adesão celular até à estimulação da diferenciação de células estaminais. Depois, exploramos a microfluídica de foco 3D para introduzir arquiteturas e compartimentos no interior de microfibras de hidrogéis, usando um único chip, até diâmetros totais inferiores a 50μm. Demonstramos também como estas arquiteturas podem ser combinadas com células e biomateriais para modelar a invasão 3D de cancro, redes vasculares, bem como criar estruturas multifuncionais de engenharia de tecidos. Finalmente, estabelecemos uma interface entre fibras de hidrogéis com diferentes compartimentos e o transporte de luz, em fibras óticas à base de polissacáridos. Estas fibras conseguem detetar deformações 3D, a presença de biomoléculas de interesse, bem como transportar células vivas, enquanto guiam luz. As fibras óticas vivas são depois usadas para converter eventos biológicos complexos em sinais óticos diretamente quantificáveis, acompanhando o crescimento 3D de células tumorais e identificando patamares inibitórios de fármacos com alta eficiência. Os resultados desta tese demonstram a ampla aplicabilidade da biofabricação de hidrogéis guiada por microfluídica, bem como a sua capacidade para miniaturizar, modelar, e converter eventos biológicos em dados quantificáveis, com alto potencial para o futuro da medicina de precisão.