Development of biofunctionalized tubular scaffolds for vascular tissue engineering applications

Abstract

One of the major problems related to small-diameter blood vessels replacement is the lack of vascular grafts with suitable mechanical and biological properties. Although there are synthetic vascular grafts in clinical use, these substitutes present thrombogenic behaviour and are too stiff compared to native vessels. Rapid endothelialization and matched mechanical properties are important functional requirements that vascular grafts should accomplish. Herein, an electrospun tubular fibrous (eTF) scaffold was fabricated and functionalized to immobilize tropoelastin at the luminal surface, providing a biomimetic environment to enhance endothelialization. The morphology was assessed by scanning electron microscopy, the effectiveness of surface functionalization by NH2 groups quantification and surface charge measurements, and the mechanical properties by uniaxial tensile tests. Tropoelastin was immobilized at 20 μg/mL by its -NH2 functional groups on activated scaffolds, as well as by its -COOH functional groups on aminolysed scaffolds, in an attempt to expose different conformations of tropoelastin for cell binding. The amount of immobilized tropoelastin on both substrates was quantified by microBCA assay. These constructs were cultured with a cell line of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) for 7 days, to study the endothelialization of eTF scaffolds by evaluating their metabolic activity, proliferation, total protein synthesis, VEGF secretion, as well as cell morphology and phenotype maintenance. Our experimental characterization demonstrated that the eTF scaffolds have a thickness of 240.85 ± 46.91 μm and their luminal surface was 33.55 % porous mix of micro to submicro fibers diameters, pore sizes less than 23 μm and pore areas up to 70 μm2. The eTF scaffolds were successfully functionalized by the insertion of 0.5 ± 0.04 nmol/mg of NH2 groups at their surface and confirmed by the differences observed in surface charge. Untreated, activated and aminolysed scaffolds supported higher stresses and strains in axial direction rather than in radial direction. These values are compatible to those of native blood vessels. The exposure of tropoelastin -COOH groups promoted endothelial cells metabolic activity and growth, whereas when exposed its -NH2 groups a significant influence on protein synthesis was observed. Additionally, eTF scaffolds promoted phenotype maintenance and endothelial cell coverage just after 7 days of culture. Altogether, the results confirm that biofunctional eTF scaffolds are suitable for vascular application since they presented adequate mechanical properties and a rapid endothelialization.

Um dos maiores problemas associados à substituição de vasos sanguíneos de pequeno diâmetro é a insuficiência de enxertos vasculares com propriedades mecânicas e biológicas adequadas. Embora existam enxertos vasculares sintéticos na prática clínica, estes substitutos apresentam trombogenicidade e são demasiado rígidos comparativamente aos vasos sanguíneos nativos. Uma rápida endotelização e propriedades mecânicas semelhantes aos vasos sanguíneos humanos são requisitos essenciais que um excerto vascular deve possuir. Neste trabalho, estruturas tubulares fibrosas foram produzidas por electrospinning (eTF scaffolds) e funcionalizadas para imobilizar tropoelastina na superfície interna, proporcionando um ambiente biomimético para promover a endotelização. A morfologia foi analisada por microscopia eletrónica de varrimento (SEM), a eficiência da funcionalização da superfície pela quantificação dos grupos amina (-NH2) e pela carga de superfície, e as propriedades mecânicas foram analisadas por testes uniaxiais à tração. A tropoelastina foi imobilizada a uma concentração de 20 μg/mL através dos seus grupos -NH2 nos eTF scaffolds activados, bem como pelos seus grupos carboxílicos (-COOH) nos scaffolds aminolisados, de forma a expor diferentes conformações para a ligação com as células. A quantidade de tropoelastina imobilizada em ambos os substratos foi quantificada através do método microBCA. Por último, os eTF scaffolds foram semeados com uma linha celular de células endoteliais da veia umbilical humana durante 7 dias para estudar a endotelização. Desta forma, a atividade metabólica, a proliferação celular, a síntese proteica e de VEGF, bem como a morfologia celular e a manutenção do fenótipo dos eTF scaffolds foram investigadas. Os resultados experimentais demonstraram que os eTF scaffolds possuem uma espessura de 240.85 ± 46.91 μm e uma superfície interna 33.55% porosa com diâmetros de fibras na ordem do micro ao submicro, tamanhos de poros inferiores a 23 μm e áreas de poros até 70 μm2. Os eTF scaffolds foram efetivamente funcionalizados através da inserção de 0.5 ± 0.04 nmol de grupos NH2 na superfície e pelas diferenças observadas na carga de superfície. Os eTF scaffolds não tratados, activados e aminolisados suportaram tensões e elongamentos mais elevados na direção axial do que na radial. Estes resultados obtidos são compatíveis com os valores reportados para os vasos sanguíneos nativos. A exposição dos grupos -COOH da tropoelastina induziu um aumento da atividade metabólica e crescimento das células endoteliais. Quando expostos os grupos -NH2, uma influência significativa na síntese proteica foi observada. Além disso, os eTF scaffolds promoveram a manutenção do fenótipo e a formação de uma monocamada de células endoteliais na superfície após 7 dias de cultura. De um modo geral, estes resultados confirmam que estes eTF scaffolds biofuncionais são adequados para aplicação vascular, uma vez que apresentam propriedades mecânicas adequadas e uma rápida endotelização.