Magnetic hyperthermia assisted genetic amplification

Abstract

A amplificação controlada de um gene desejado envolvido em uma patologia humana poderia potencialmente permitir o tratamento. Para isso, nano-vetores que combinem capacidades de diagnóstico e tratamento são de grande interesse. Muitos relatórios propuseram sistemas de entrega capazes de distribuir as ferramentas necessárias para amplificação de genes aos tecidos, mas esses sistemas carecem de especificidade e controlo. A combinação de enzimas termo estáveis com nanopartículas magnéticas (MNPs) e hipertermia na forma de campos magnéticos alternados (AMF), pode ser um fator revolucionário neste campo. Enzimas termo-estáveis (por exemplo, Taq polimerase) atingem sua atividade ideal em temperaturas bem acima da temperatura corporal e a aplicação de AMF a nanopartículas magnéticas pode induzir especificamente e localmente um aumento na temperatura. Isso, quando as MNPs são funcionalizadas com as enzimas termoestáveis, permitirá um controle sob demanda da atividade enzimática, aumentando a especificidade e reduzindo potenciais efeitos fora do alvo. Nesta tese, nanopartículas de magnetite foram sintetizadas pelo método hidrotérmico e funcionalizadas via reações de acoplamento peptídico com a Taq polimerase. A amplificação de um gene selecionado foi possível com nanopartículas de magnetite revestidas com ácido poliacrílico (Fe3O4@PAA) funcionalizadas com Taq, pois esta enzima manteve sua funcionalidade após a funcionalização. O grande potencial de aquecimento da magnetite é explorado ao longo do projeto, à medida que as temperaturas necessárias para as fases específicas de amplificação do gene são atingidas (sob campos magnéticos alternados). A amplificação assistida por hipertermia magnética foi tentada, mas sem sucesso. O sistema desenvolvido mostrou-se enzimaticamente funcional e capaz de gerar calor. Apesar de não ter conseguido provar a prova de conceito, esse esforço abre caminho para a amplificação gênica controlada externamente e representa o primeiro exemplo de uma nova tecnologia para a ativação sob demanda de enzimas com controle espacial.

The controlled amplification of a desired gene involved in a human pathology could potentially allow for treatment. To this end, nano-vectors that combine diagnosis and treatment capabilities are of great interest. Many reports have proposed delivery systems able to distribute the necessary tools for gene amplification to tissues, but these systems lack specificity and control. The combination of thermostable enzymes with magnetic nanoparticles (MNPs) and hyperthermia in the form of alternating magnetic fields (AMF), can be a game changer in this field. Thermostable enzymes (e.g. Taq polymerase) reach their optimal activity at temperatures well above body temperature and the application of AMF to magnetic nanoparticles can specifically and locally induce an increase in temperature. This, when the MNPs are functionalised with the thermostable enzymes, will enable an on-demand control of the enzymatic activity, increasing specificity and reducing potential off-target effects. In this thesis, magnetite nanoparticles were synthesised by the hydrothermal method and were functionalized via peptide coupling reactions with Taq polymerase. Amplification of a selected gene was possible with Taq-functionalised polyacrylic acid coated magnetite nanoparticles (Fe3O4@PAA), as this enzyme retained its functionality after functionalization. Magnetite great heating potential is further explored throughout the project, as the temperatures required for the specific phases of gene amplification are attained (under alternating magnetic fields). Magnetic hyperthermia assisted amplification was attempted, yet unsuccessful. The developed system proved to be enzymatically functional and capable of heat generation. Despite being unsuccessful in proving the proof-of-concept, this effort pave the way for externally controlled gene amplification, and represents the first example of a new technology for the on-demand activation of enzymes with spatial control.