Seleção de estirpes de yarrowia lipolytica com potencial para produzir álcoois aromáticos

Abstract

O 2-Feniletanol (2-Fe) é um álcool aromático com aroma de rosas cuja produção já foi reportada utilizando vários microrganismos, no entanto a Yarrowia lipolytica, apesar de apresentar características que a tornam interessante para a produção deste álcool, é ainda pouco explorada. Assim, o principal objetivo deste trabalho consiste em explorar o potencial da Y. lipolytica para a produção do 2-Fe por biotransformação da L-Fenilalanina (L-Fe), combinando a seleção de estirpes, a utilização de substratos alternativos, a otimização das condições de cultura, modo de operação e aplicação de técnicas de remoção de produto. Para tal, foi inicialmente avaliado o efeito inibitório do 2-Fe no crescimento de duas estirpes de Y. lipolytica, W29 e CH1/5, tendo-se verificado que concentrações de 2-Fe iguais ou superiores a 2 g L-1 inibem completamente o crescimento de ambas as estirpes. Posteriormente, foi demonstrado que ambas as estirpes foram capazes de produzir 2-Fe via de novo síntese, apesar das concentrações obtidas serem reduzidas. De seguida, a capacidade de produção de 2-Fe foi avaliada em matraz, com glucose como fonte de carbono tendo-se obtido cerca de 1 g L-1 de 2-Fe em ambas as estirpes. Apesar não de terem sido obtidas diferenças significativas, a estirpe CH1/5 foi selecionada para os ensaios seguintes. Posteriormente, foi avaliado o efeito da concentração de L-Fe na produção do aroma, tendose verificado que este aumento não favoreceu a produção de 2-Fe (2 vs 0,5 g L-1 com 4 e 6 g L-1 de LFe, respetivamente). O glicerol bruto foi avaliado como fonte de carbono alternativa para a produção de 2-Fe, tendo sido obtidos resultados semelhantes aos obtidos com glucose. Foi ainda testada uma estratégia de produção com remoção do produto por adsorção. A adição de 7 % (p/v húmido) da resina XAD-4-HP ao meio permitiu aumentar em 1,3 vezes o rendimento de 2-Fe quando comparada com os ensaios sem remoção de produto. A produção de 2-Fe pela estirpe CH 1/5 foi também estudada em biorreator, tendo sido avaliada a influência da taxa de transferência de oxigénio e do pH na sua produção. Observou-se que as concentrações de 2-Fe obtidas, para a gama de taxas de transferência de oxigénio estudadas, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, no entanto a acidificação do meio (pH 5,5) permitiu aumentar a produção de 2-Fe (0,31 g L-1). O modo de operação semi-contínuo com alimentação por pulsos de L-Fe permitiu aumentar a produção de 2-Fe tendo-se obtido uma concentração final de 2,65 g L-1.

The 2-Phenylethanol (2-PE) is an aromatic alcohol with a delicate fragrance of rose petals. Although there are many works in the literature about 2-PE production by several yeasts’ strains, the yeast Yarrowia lipolytica was poorly explored in this field, despite appearing to be a competitive producer. Thus, the main objective of this work is to explore the potential of Y. lipolytica for 2-PE production by L-phenylalanine (L-Phe) bioconversion, combining strain selection, the use of alternative substrates, optimization of culture conditions, mode of operation and application of product removal techniques. Initially, it was studied the inhibitory effect of 2-PE on Y. lipolytica growth, and it was observed that all strains were inhibited by 2-PE concentrations equal or above 2 g L-1. It was confirmed that all strains were able to produce 2-PE by de novo synthesis. Thereafter, the ability of both strains to produce 2-PE was assessed at shake flask-scale, with glucose as the carbon source, and a 2-PE concentration of 1 g L-1 was attained for both strains. Although no significant differences were observed between both strains, the strain CH1/5 was selected for the further experiments. Afterwards, it was studied the effect of L-Phe concentration in 2-PE production, and it was observed that increasing L-Phe concentrations decreases the aroma production (2 vs 0,54 g L-1 with 4 and 6 g L-1 of L-Phe, respectively). Crude glycerol was tested as an alternative carbon source for 2-PE production, and when compared with results attained with glucose, a similar 2-PE titer was obtained with this carbon source. It was also tested a bioconversion strategy coupled with product removal by adsorption using XAD-4-HP. The addition of 7 % (wet w/v) resin to the bioconversion system allowed a 1,3-fold increase in the 2-PE yield compared to the bioconversion without addition of the adsorbent resin. The influence of oxygen transfer rate and pH on 2-PE production with CH 1/5 strain was also studied at bioreactor scale. It was observed that the production of 2-Fe is not affect by the oxygen transfer rates, for the range of conditions studied, whereas a more acidic environment (pH 5,5) allow a high 2-PE titer. A stepwise fedbatch cultures improved the 2-Fe production allowing a maximum production of 2,65 g L-1.